Investigación Biomédica con Técnicas de haces de iones
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* Fig. 1


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* Fig. 2. [1]


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* Fig. 3


Las técnicas con haces de iones pueden ser utilizadas tanto para realizar modificación de materiales, como para obtener información estructural y elemental de las muestras bajo estudio. En todos los casos son numerosas las aplicaciones biomédicas.

El conocimiento de los elementos, y en particular de los elementos traza, que componen una muestra biomédica puede ser determinante para resolver muchos problemas médicos. Las técnicas IBA (del inglés, Ion Beam Analysis) son una herramienta rápida, eficaz y de alta sensibilidad (pueden detectar concentraciones del orden de µg/g) para la detección de concentraciones elementales.

Los estudios más simples con técnicas con haces de iones en muestras biológicas, consisten principalmente, en la determinación de las concentraciones elementales del volumen total de muestras usando un haz de iones de pocos milímetros mediante la técnica PIXE (Particle Induced X-ray Emission). Esta técnica se puede aplicar a una gran diversidad de tejidos (dientes, úteros, cerebro, sangre, hígado…). La preparación de las muestras suele ser bastante simple y algunos tejidos duros como dientes, no precisan preparación, evitando cualquier tipo de alteración en la muestra que pueda afectar a los resultados finales. Usando también un haz de pocos milímetros, las técnicas RBS (Rutherford Backscattering Spectrometry) y ERDA (Elastic Recoil Detection Analysis) se han usado con éxito para la caracterización de biomateriales. Sin embargo, el uso generalizado de las técnicas de microscopía nuclear en micro- y nanosondas de iones, ha sido lo que realmente ha impulsado las aplicaciones de las técnicas de haces de iones en biomedicina.

La microscopía nuclear está compuesta por un conjunto de técnicas complementarias (STIM, PIXE y RBS), que pueden aplicarse simultáneamente, con capacidad para obtener imágenes de las variaciones de densidad y mapas de distribución de los elementos traza (Fig. 1), usando iones con energías de pocos MeV y altamente focalizados. Las técnicas de microscopía nuclear han sido aplicadas con éxito a gran variedad de tejidos biológicos como piel, hueso, cerebro, páncreas, arterias, pulmones… En los últimos años, las mejores conseguidas en la focalización de los haces de iones ha hecho posible trabajar de forma rutinaria con haces sub-100nm. Con estos haces se han conseguido imágenes nanoSTIM de tejido y células individuales, resolviendo los núcleos de las células y varios nucléolos (Fig. 2). Los primeros resultados usando nanoSTIM sobre células completas han mostrado que esta técnica tiene un gran potencial para el recuento de nanopartículas (NPs) y la obtención de imágenes estructurales de NPs dentro de las células (Fig.3).

La técnica STIM también se puede combinar imágenes subcelulares fluorescentes inducidas por protones (PIF, proton induced fluorescence)  con una resolución de 200nm (las imágenes fluorescentes ópticas convencionales alcanzan resoluciones de 300-400nm) en una línea de microsonda nuclear (Fig.2). La combinación de las imágenes nanoSTIM con imágenes fluorescentes ofrece una herramienta eventualmente potente en la búsqueda para elucidar la función celular, particularmente siendo posible obtener imágenes sub-50nm en el futuro cercano.

Otra de las aplicaciones de las técnicas microscopía nuclear es la obtención de imágenes tomográficas. Hasta el momento, se han obtenidos imágenes 3D de densidad de diversos tipos de células. Con esta técnica se puede obtener información sobre el interior de la células sin necesidad hacer ningún corte transversal de la misma.

Finalmente, la gran capacidad de los haces de partículas para modificar materiales tiene también dos campos de aplicación importantes en biomedicina: la irradiación celular y la creación de distintos dispositivos para aplicaciones biomédicas. En ambas aplicaciones las dimensiones cada vez más reducidas de los haces de trabajo, así como el control de los mismos son herramientas decisivas. El objetivo de los experimentos de irradiación celular es determinar los efectos de bajas dosis de radiación sobre las células vivas. Para ello, células cultivadas se irradian ion a ion de forma individual en lugares muy localizados. Posteriormente se observa cual es la evolución de la célula en función del número de iones que han impactado con ella y del lugar de impacto. Es bien conocido que el comportamiento de las células, es decir, su acoplamiento, proliferación, orientación, migración y función, viene determinado por la topografía de la superficie del sustrato y sus propiedades químicas. Mediante el uso controlado de micro y nanohaces de partículas se puede fabricar una gran diversidad de sustratos de crecimiento celular. De forma análoga, los haces de partículas pueden ser utilizados para crear micro- y nanocanales 3D de muy baja rugosidad en polímeros para el trasporte de microfluídos, separación de células bacterianas y para la detección de moléculas individuales usando espectroscopía fluorescente. También se pueden fabricar biochips que pueden soportar células, ADN y proteínas grandes.


La actividad del CMAM en el campo biomédico se apoya en primer lugar sobre un completo equipamiento para la preparación de muestras biológicas que comprende: criotomo, liofilizador, bombas de digestión acida con un horno microondas asociado, microscpio óptico con adquisición de imágenes digitales y cortadora/pulidora por tejidos duros (dientes, huesos,…). La herramienta más importante es la línea de microhaz interno situada a +30° donde se trabajará con un haz micrométrico o sub-micrométrico. Esta línea se está optimizando para el análisis de tejidos biológicos y para realizar estudios sobre la interacción de nanopartículas, de diferentes tamaños, con células madre mesenquimales (MSCs).

En el campo de los biosensores se están abriendo en el CMAM interesantes prospectivas relacionadas con la posibilidad de crear modificaciones de materiales, como el silicio, mediante bombardeo con iones pesados y consiguiente amortización, según dibujos preestablecidos. Se observan disposiciones preferentes de los órganos celulares.


Fig. 1.  Imágenes correspondiente a una sección de piel de ratón. 1- Imagen obtenida con microscopía electrónica. 2- Mapa de STIM. 3- Mapa de C obtenido con RBS. 4- Mapa de S. 5- Mapa de P. 6- Mapa de K, los tres últimos obtenidos mediante la técnica PIXE. En las imágenes se aprecia claramente las distintas capas de la piel Stratum Corneum (SC), Stratum Lucidum (SL), Stratum Granulosum (SG), Stratum Spinosum (SS) y Dermis. Los mapas se han obtenido con un haz de protones de 2.5 MeV y 1 µm de diámetros en las instalaciones del CENBG (Centre d'Etudes Nucléaires de Bordeaux Gradignan).
Fig. 2.  Imágenes de una célula  N2A blastoma teñida con ácido nucleico verde SytoxR: (a) Microscopía cofocal, (b) STIM con protones, (c) STIM con partículas alfa, y (d) Fluorescencia inducida con protones. Las imágenes con protones se tomaron usando un tamaño de haz de 200 nm, la imagen de STIM  con partículas alfa se tomó usando un haz de partículas de 59 nm de diámetro [1]
Fig. 3.  Imagen STIM de una célula completa (fibroblasto fetal de pulmón MRC-5 (ATCC No. CC-171)) obtenida usando partículas alpha de 1.5 MeV (STIM). La célula se ha crecido en un medio

[1] F. Watt, A.A. Bettiol, J.A. van Kan, M.D. Ynsa, Ren Minqin, R. Rajendran, Cui Huifang, Sheu Fwu-Shen, A.M. Jenner, Imaging of single cells and tissue using MeV ions, Nucl. Instrum. and Meth. B 267 (2009) 2113-2116.